Émergence d’espèces de Klebsiella résistantes aux carbapénèmes possédant des KPC- hydrolysant le carbapénème de classe A et des TEM-β-lactamases résistantes aux inhibiteurs dans la ville de New York

Dix-neuf isolats d’espèces de Klebsiella résistantes aux carbapénèmes ont été retrouvés dans des hôpitaux de New York. La plupart des K pneumoniae appartenaient à un seul ribotype. Un séquençage nucléotidique identifié: KPC-, une β-lactamase hydrolysante au carbapénème dans des souches, TEM-, une β-lactamase résistante aux inhibiteurs. , a été détectée Les espèces de Klebsiella résistantes au carbapénème possédant le KPC sont endémiques à New York Cette étude documente l’identification d’une β-lactamase TEM résistante aux inhibiteurs aux Etats-Unis.

Au cours des dernières décennies, l’utilisation accrue de céphalosporines s’est accompagnée de l’émergence d’Enterobacteriaceae possédant des β-lactamases à spectre étendu. L’émergence d’espèces de Klebsiella productrices de BLSE a été particulièrement problématique à New York Bien que plusieurs genres aient été trouvés pour transporter les BLSE, Klebsiella pneumoniae représente la majorité des isolats Les espèces de Klebsiella portant ces enzymes sont fréquemment résistantes à d’autres classes d’antibiotiques, y compris les aminosides, les fluoroquinolones et les sulfamides Les carbapénèmes sont considérés comme les agents de choix pour le traitement des graves obstétrique. infections dues à des isolats possédant des ESBLs La résistance au carbapénème a été rapportée chez un petit nombre d’entérobactéries et est causée par un certain nombre de mécanismes. Premièrement, la combinaison de la production élevée d’une β-lactamase AmpC et de la perte de protéines de la membrane externe a été associée. avec résistance au carbapénème chez K pneumoniae et Enterobacter sp ecies Deuxièmement, la découverte de β-lactamases carbapénem-hydrolysantes efficaces chez les Enterobacteriaceae reste inhabituelle mais semble augmenter Deux classes distinctes de β-lactamases ont la capacité d’hydrolyser les carbapénèmes Bien que les métallo-β-lactamases de classe B soient habituellement associées à Pseudomonas aeruginosa et Acinetobacter baumannii, ils peuvent également être trouvés dans K pneumoniae Un petit nombre de β-lactamases de classe A possèdent une activité hydrolytique contre les carbapénèmes SME- et SME- ont été retrouvés dans des isolats résistants au carbapénème de Serratia marcescens , et GES- a été récupéré à partir de P aeruginosa IMI- et NMC-A ont été récupérés dans des isolats d’Enterobacter cloacae L’une des enzymes hydrolysant les carbapénèmes de classe A les plus fréquemment rencontrés est le KPC de type β- lactamases Ces enzymes sont capables d’hydrolyser efficacement les pénicillines, les céphalosporines, l’aztréonam et les carbapénèmes et sont inhibées par l’acide clavulanique et le tazobactam. Le rapport de l’une de ces β-lactamases, KPC-, impliquait une souche de K pneumoniae résistante au carbapénème, récupérée en Caroline du Nord . Cette enzyme se trouvait sur un plasmide transférable. Peu de temps après, des rapports du nord-est des États-Unis pneumoniae , Klebsiella oxytoca , Salmonella enterica , et E cloacae exprimant le KPC-surface Le gène blaKPC- diffère de blaKPC- par un seul nucléotide et confère également une sensibilité réduite aux carbapénèmes Récemment, les isolats résistants au carbapénème de Escherichia coli dans le New Jersey et K pneumoniae à New York possédant blaKPC – qui diffère de blaKPC – par un seul nucléotide ont été retrouvés. Dans certains de ces rapports, une production diminuée des porines de la membrane externe a été notée contribuent également à la résistance au carbapénèmeNous rapportons maintenant l’émergence d’espèces de Klebsiella possédant les β-lactamases de classe A hydrolysant le carbapénème KPC à New York, ainsi que le premier rapport d’un inhibiteur-resista nt-β-lactamase de type TEM aux Etats-Unis

Matériaux et méthodes

Des isolats d’espèces de Klebsiella présentant une sensibilité réduite aux carbapénèmes ont été prélevés dans des isolats de l’hôpital Queens et des isolats de Brooklyn, New York. Les isolats de Queens ont été sélectionnés car une sensibilité réduite à l’imipénème a été identifiée lors des premiers essais. lors de surveillances à l’échelle de la ville évaluant les taux de résistance bactérienne ; les isolats restants ont été envoyés aux investigateurs en raison de leur modèle de résistance inhabituel. Les isolats ont été identifiés au moyen de critères standards et les tests de sensibilité ont été réalisés selon la méthodologie NCCLS. Tous les isolats de K pneumoniae ont été soumis au ribotypage

Figure Vue grandDownload slideRibotypage des isolats cliniques de Klebsiella pneumoniae exprimant KPC- effectué avec le système RiboPrinter Qualicon avec EcoRI comme enzyme de restriction Douze des isolats ont été regroupés par programme dans un ribogroupe commun Ceci comprenait des souches isolées à la fois de Brooklyn et de Queens, New York Résultats obtenus avec une deuxième enzyme de restriction PvuII, données non montrées Figure 11: DiapositiveTéléchargement des isolats cliniques de Klebsiella pneumoniae exprimant KPC- avec le système RiboPrinter Qualicon avec EcoRI comme enzyme de restriction Douze des isolats ont été regroupés par programme dans un ribogroupe commun. isolés à la fois de Brooklyn et de Queens, New York Des résultats similaires ont été obtenus avec une seconde enzyme de restriction PvuII, données non montrées. Les β-lactamases ont été caractérisées par isoélectrofocalisation selon des méthodes établies En résumé, les cellules cultivées en phase logarithmique rompus par des cycles de congélation-décongélation en mol / L d’acétate de sodium et des surnageants centrifugés ont été utilisés pour la focalisation isoélectrique avec un appareil LKB Multiphor avec des PAGplates préparés pH, -; Pharmacia LKB et β-lactamases déterminées après superposition avec nitrocephin Le point isoélectrique pI a été déterminé après comparaison avec des β-lactamases standard connues Les surnageants d’isolats sélectionnés ont également été analysés pour la preuve spectrophotométrique de l’activité carbapénémase en mmol / L pH HEPES, avec mmol / L ZnCl Inhibition de l’activité hydrolytique a également été évaluée par spectrophotométrie après l’ajout de μmol / L acide clavulanique ou mmol / L EDTA β-lactamases ont été identifiés par amplification au moyen de protocoles établis avec les amorces suivantes: TEM avant, ‘-GTGCGCGGAACCCCTATT- ‘; TEM inverse, ‘-TTACCAATGCTTAATCAGTGAGGC-‘; SHV en avant, ‘-CTTTACTCGCCTTTATCGGC-‘; SHV inverse, ‘-TTACCGACCGGCATCTTTCC’; KPC forward, ‘-ATGTCACTGTATCGCCGTCT-‘; KPC reverse, ‘-TTTTCAGAGCCTTACTGCCC-‘ Des fragments d’ADN amplifiés ont été clonés dans pCR avec le kit TOPO TA Invitrogen Le séquençage nucléotidique a été effectué sur les deux brins de l’ADN provenant de clones résultant de réactions de PCR indépendantes au moins avec le kit de séquençage Big Dye. Système de séquençage d’ADN Applied Biosystems, comme décrit ailleurs Les séquences d’ADN ont été identifiées par le programme BLAST du site Web du Centre national de la biotechnologie http: // wwwcnbinlmnihgov / BLASTLes dossiers médicaux ont été examinés pour obtenir des informations démographiques et cliniques essentielles. à l’emplacement du patient, la durée de l’hospitalisation et l’antibiothérapie avant le rétablissement de l’isolat résistant au carbapénème

Résultats

Un total d’isolats d’espèces de Klebsiella produisant des β-lactamases hydrolysant le carbapénème ont été récupérés entre novembre et juillet auprès de différents hôpitaux de New York. Dix-huit ont été identifiés comme K pneumoniae et le dernier était K oxytoca. La CMI de l’imipénème était μg / mL pour un isolat et à & gt; μg / mL pour tous les autres Quatre isolats d’hôpitaux ont été identifiés à l’origine par les laboratoires de microbiologie clinique comme sensibles à l’imipénème. Ces isolats ont été recueillis lors de l’étude de surveillance à Brooklyn. Un de ces hôpitaux utilisait le système Dade Microscan Walkaway; la seconde a utilisé le système Vitek bioMérieux Ces isolats ont été confirmés plus tard résistants à la dilution en gélose et aux tests E dans le laboratoire de recherche de l’un des principaux investigateurs La CMI réelle de l’imipénème était de – μg / mL pour ces isolats. résistant aux aminoglycosides et aux fluoroquinolones

Tableau View largeTélécharger la lameβ-Lactamase et les données de susceptibilité pour les isolats de Klebsiella possédant KPC-carbapénemaseTable View largeTélécharger la lame β-Lactamase et les données de sensibilité pour les isolats de Klebsiella possédant KPC-carbapénémaseSur les isolats de K pneumoniae, les ribotypes ont été identifiés. ont été récupérés à partir de différents hôpitaux Les isolats récupérés à partir d’un hôpital dans le Queens appartenaient à des ribogroupes, y compris le ribotype dominant. Les isolats de K pneumoniae prélevés à Brooklyn ont été répartis entre les hôpitaux; le ribotype prédominant représenté de ces isolats Il n’y avait pas d’association épidémiologique évidente reliant ces isolatsLa caractérisation isoélectrique des β-lactamases a révélé des enzymes multiples dans tous les isolats. Toutes les β-lactamases présentes dans ces souches n’ont pas été identifiées par PCR et séquençage nucléotidique. Un pI de a été trouvé uniformément dans tous les isolats et a ensuite été identifié comme KPC- par séquençage de nucléotides. Les surnageants contenant des β-lactamases des isolats de Brooklyn ont démontré une hydrolyse spectrophotométrique efficace de l’imipénème qui a été inhibée par l’acide clavulanique. KPC-enzyme, plusieurs différentes β-lactamases de type TEM et SHV ​​ont été identifiées dans les souches. Quinze des souches possédaient une BLSE, dont SHV ​​a été identifiée- Bien que le pI publié de SHV- soit, dans cette étude particulière, le pI expérimental était En outre, une β-lactamase avec un pi de a été identifié comme TE M-in des isolats de K pneumoniaeL’âge médian des patients chez lesquels l’espèce Klebsiella possédant KPC était isolée était des années Neuf isolats ont été retrouvés dans des cultures d’urine, avec une infection active restante Les isolats restants ont été récupérés à partir d’échantillons d’expectorations, représentant la colonisation, le sang isolats, et isolats divers sources, tous représentant la colonisation Des informations cliniques étaient disponibles pour les patients Tous les isolats ont été acquis nosocomialement, avec une durée médiane d’hospitalisation de jours avant que la culture ait donné l’organisme Dix isolats ont été acquis pendant l’hospitalisation; Bien que l’utilisation antérieure de carbapénème n’ait été documentée que dans les cas examinés, les antécédents d’administration de β-lactamines β-lactamines / inhibiteurs de la β-lactamase à large spectre ont été observés ou des céphalosporines étaient évidentes. Dans les cas, trois des patients avec une infection vraie ont survécu à l’hospitalisation. Parmi les patients ayant une infection des voies urinaires, un a été traité avec succès par pipéracilline-tazobactam et imipénème et l’autre a été traité avec succès par l’imipénème et la polymyxine. a été traité avec succès avec l’imipénème et l’amikacine, et le patient avec une infection des voies respiratoires inférieures n’a pas survécu, malgré le traitement par la ciprofloxacine et la polymyxine

Discussion

Avec l’augmentation des taux de résistance des bacilles Gram négatif aux céphalosporines et aux fluoroquinolones , l’accent a été mis sur les carbapénèmes pour le traitement des infections nosocomiales graves. L’émergence de pathogènes nosocomiaux Gram négatif résistants aux carbapénèmes s’est généralement limitée à P aeruginosa et A baumannii A ce jour, seuls des isolats rares de P aeruginosa résistant aux carbapénèmes en provenance des États-Unis possèdent une β-lactamase hydrolysante au carbapénème La découverte d’une enzyme efficace contre les carbapénèmes dans des isolats d’espèces de Klebsiella de plusieurs hôpitaux La présence de KPC- chez K pneumoniae peut augmenter la CMI de l’imipénème, mais pas au même niveau que la CIM. de la résistance franche Par conséquent, les souches portant cette enzyme peuvent seulement être reconnues En effet, les isolats résistants à l’imipénème de notre rapport n’ont pas été identifiés comme résistants par les laboratoires de microbiologie clinique. Dans la plupart des isolats de Klebsiella possédant KPC-, les CMI de l’imipénème ont été – μg / mL le point de rupture du NCCLS de μg / mL Cependant, l’utilisation d’un point de rupture de l’imipénème de μg / mL pour dépister ces isolats a été suggérée Le fait que plusieurs de nos isolats ont été acquis nosocomialement dans des hôpitaux qui ne présentaient pas d’infection manifeste. Les Klebsiella résistantes aux carbapénèmes suggèrent qu’une diminution de la sensibilité au carbapénème due à la KPC est non reconnue. La KPC a également été retrouvée dans des isolats du Maryland et de Boston [,,,], et l’enzyme KPC a été retrouvée à Manhattan et au New Jersey. ] Ces résultats suggèrent que l’évolution des carbapénémases est un problème régional. Les données de typage des souches génétiques dans cette étude démontrent la propagation d’une souche prédominante de K pneum oniae portant KPC- à plusieurs hôpitaux dans notre région; cette souche représente le% de K pneumoniae possédant des BLSE à Brooklyn Cependant, plusieurs souches uniques ont également été récupérées, et d’autres études ont confirmé que KPC- réside sur un plasmide transmissible Le développement de résistance aux carbapénèmes chez Klebsiella implique typiquement Plusieurs mécanismes La présence d’une β-lactamase carbapénème-hydrolysante efficace est certainement un facteur important. Tous nos isolats contenaient également d’autres β-lactamases, bien qu’aucun d’entre eux ne possède une activité hydrolytique significative contre les carbapénèmes. Les β-lactamases de classe A ou C contribuent également à la résistance aux carbapénèmes chez les espèces de Klebsiella [-,,] Une porine particulière, OmpK, peut être importante pour l’entrée des carbapénèmes dans les espèces Klebsiella La résistance au carbapénème peut aussi être médiée par les systèmes d’efflux. aeruginosa et les protéines altérées de liaison à la pénicilline chez Proteus mirabilis ; Les facteurs contribuant à l’espèce Klebsiella nécessiteront une étude plus approfondie. En plus de l’enzyme KPC, plusieurs BLSE ont été détectées dans nos isolats de K pneumoniae. De plus, TEM-, un variant de TEM résistant aux inhibiteurs, a été détecté dans des souches. est le premier rapport d’une enzyme résistante aux inhibiteurs trouvée dans des isolats provenant des États-Unis. Les β-lactamases de type TEM résistantes aux inhibiteurs ont été largement rapportées en Europe mais moins ailleurs Dans cette étude, les souches de K pneumoniae – avait de multiples β-lactamases, y compris la BLSE de BLSE et la β-lactamase KPC de la classe A hydrolysant le carbapénème. La combinaison de multiples β-lactamases peut souvent rendre une souche résistante aux combinaisons de β-lactamines et de β-lactamases , il est probable que des variants TEM résistants aux inhibiteurs sont présents et sont sous-déclarés aux États-Unis parmi les isolats multirésistants, comme nos souches de K pneumoniaeThérapie pour les infections causées par Les isolats de Klebsiella résistants à l’imipénème seront difficiles Les isolats de ce rapport sont résistants à tous les antibiotiques β-lactamines, et la plupart résistent aux aminoglycosides et aux fluoroquinolones. La question de savoir si la polymyxine fournira un traitement efficace reste à déterminer. région a créé de sérieux dilemmes concernant la détection, la thérapie et le contrôle

Remerciements

Soutien financier Financement de recherche de Merck, Pfizer et Wyeth Pharmaceuticals DL et JQ; soutien financier de BMA Medical Foundation, de la Fondation Beatrice Snyder et d’Agnes Varis CU et NM