Préparation, activité antibactérienne Gram négatif et stabilité hydrolytique des nouveaux sidérophores Dios Monocarbam Conjugated

Multidrug résistance chez les non-fumeurs Gram négatif tels que Pseudomonas aeruginosa est un problème de santé publique significatif.1 Particulièrement inquiétant est la résistance croissante que ces agents pathogènes présentent maintenant à plusieurs classes d’antibiotiques de première ligne.2 Alors que les antibiotiques à large spectre tels que les carbapénèmes et les fluoroquinolones maintiennent leur activité contre la plupart des souches, il y a une érosion continue de l’efficacité des membres de ces classes contre P. aeruginosa multirésistante (MDR). 3, 4 Combinant ce fait avec les résultats d’études de surveillance multiples suggérant 50% de toutes les infections nosocomiales sont MDR Gram négatif dans la nature rend le besoin de nouveaux agents capables de Il est apparu clairement que cette menace médicale était évidente5,6. Il y a eu peu de nouvelles introductions d’antibiotiques avec une activité significativement améliorée contre ces souches MDR au cours de la dernière décennie. Des modifications des classes existantes d’antibiotiques se sont avérées infructueuses en fournissant une activité puissante contre les souches MDR qui possèdent de multiples mécanismes de résistance. Dans ce domaine, les efforts pour trouver des antimicrobiens entrant dans les pathogènes MDR par des mécanismes innovants ont été évités, évitant ainsi de nombreuses mutations d’efflux et de perméabilité. Une stratégie pour contourner la résistance de ces pathogènes consiste à exploiter la voie d’assimilation du fer de ces bactéries. Cette approche a été étudiée par un certain nombre de groupes dans les années 1980, avec des conjugués sidérophores poursuivis principalement dans la céphalosporine et le monobactame. sous-classes.12 − 15 Le monocarbam Upjohn U-78608 (2) est un exemple de ce dernier et a été utilisé comme agent de comparaison pour ces études (Figure 11) (Figure 11) .16 Monocarbams sont monocycliques β -lactames qui sont uniques à d’autres membres de cette classe, tels que l’aztréonam (3), en ce sens qu’ils contiennent un groupe d’activation centré sur le carbone attaché à l’azote de β -lactame. les monocarbames comme 2 et le pirazmonam (4) 17 n’ont pas progressé au-delà du développement précoce malgré une activité in vitro impressionnante. Cela était probablement dû au coût élevé des biens projeté, au manque d’activité à Gram positif et au potentiel de marché insuffisant qui, à l’époque, était dominé par des lactames à large spectre efficaces et moins structurellement complexes. Aujourd’hui, cependant, en raison du paysage changeant de l’arène à Gram négatif, largement influencé par la résistance aux antibiotiques décrite ci-dessus, cette approche de conjugué sidérophore a reçu une attention renouvelée.18 Ici, nous rapportons une nouvelle série d’analogues de monocarbam sidérophore conjugués et décrivons la synthèse d’une telle molécule MC-1 (1), avec des relations d’activité de structure (SAR) associant des attributs de propriété physique avec des résultats biologiques in vivo.Figure 1MC-1 (1) et les antibiotiques monobactam liés.Sur la base des données in vitro encourageantes rapportées pour 2, nous avons initié un programme avec ce composé comme principal. Une évaluation précoce in vitro de 2 dans nos mains a montré qu’il s’agissait d’un puissant agent Gram négatif, présentant une concentration inhibitrice minimale (CMI) 90 de 2 μ g / mL contre 91 isolats cliniques de P. aeruginosa par rapport à > 64 μ g / mL pour 3 et le méropénème (tableau 3). Cette activité anti-Pseudomonale robuste s’est traduite par une excellente efficacité dans un modèle d’infection systémique murin in vivo [infecté par voie intrapéritonéale (modèle d’infection IP), Tableau 3]. Cependant, de façon quelque peu surprenante, 2 ne s’est pas bien comporté dans un modèle murin d’infection des voies respiratoires (RTI PD50 > 150 mg / kg). Cela était préoccupant car le poumon est considéré comme un organe essentiel pour démontrer l’efficacité de tout agent nosocomial Gram négatif. Les raisons de la piètre performance des RTI exposées par 2 n’étaient pas apparentes au départ; Cependant, l’instabilité hydrolytique de ces antibiotiques monocarbam (discuté plus en détail plus tard) a présenté des complications dans la détermination de certains points finaux dans les dosages nécessitant des incubations aqueuses prolongées, telles que la liaison aux protéines plasmatiques (PPB). Cependant, les efforts pour mesurer PPB pour 2 ont suggéré une liaison modérément élevée malgré la nature polaire de ce composé (fu-0,26 chez la souris). En conséquence, nous avons postulé que la modulation des propriétés physiques autour de 2 pourrait affecter PPB, augmentant ainsi les concentrations de médicaments libres disponibles pour l’activité dans les poumons. Parce que la plupart des infections ont lieu dans l’espace extravasculaire, ce sont les concentrations libres dans ce compartiment qui sont les plus pertinentes pour l’efficacité. La distribution totale des médicaments dans les poumons était généralement équivalente pour tous les analogues du monocarbam et semblable à celle observée pour l’aztréonam (rapports poumon / plasma de 0,2 et 0,22) .19 Bien que les concentrations totales de médicament dans les homogénats tissulaires puissent fournir une indication de pénétration, ces données sont souvent trompeuses, puisqu’une distribution uniforme des concentrations de médicament est supposée. Les concentrations observées dans les homogénats tissulaires reflètent une moyenne des concentrations intracellulaires et extracellulaires, ainsi qu’un médicament lié aux protéines. Cette valeur pourrait grossièrement sous-estimer les concentrations réelles de médicament libre dans l’espace extravasculaire. En l’absence de processus de transport actif, l’équilibre entre le médicament libre dans le tissu et le plasma se produit passivement à l’état d’équilibre. Cela a été démontré dans des expériences de microdialyse utilisant plusieurs antibiotiques à base de lactame. Le cefpodoxime, par exemple, est lié à 25% au plasma humain et présente des concentrations maximales non liées au pic deux fois plus élevées dans le tissu musculaire que le céfixime (65 % PPB). Ainsi, une stratégie visant à réduire la PPB pour augmenter la concentration libre dans le tissu a été poursuivie dans le but d’augmenter l’efficacité pulmonaire. La nécessité de trouver une position sur ces molécules pour manipuler l’espace physico-chimique tout en conservant une bonne adéquation in vitro puissance. Nous avons considéré un certain nombre de positions synthétiques tractables sur 2, avant de se fixer sur la chaîne latérale triazalone (méthyle). Sur la base de rapports antérieurs, il s’agissait d’une partie inexplorée de la molécule qui était en même temps distale par rapport aux portions qui avaient été précédemment optimisées, comme le siderophore et la sous-structure contenant l’aminothiazole (également présent dans 3). Les efforts pour incorporer de nouvelles fonctionnalités à cette position de la triazalone ont été facilités par l’activation de l’intermédiaire oxadiazalone 10 (Schéma 1A). Ce composé a été préparé avec un bon rendement global à partir de l’acide kojique (5) disponible dans le commerce, en six étapes chimiques. Le (R) -3-aminopropane-1,2-diol (11) a été introduit dans une séquence en deux étapes impliquant l’addition de l’amine, suivie d’une cyclisation pour former la triazalone 12 (tandis que le schéma 1A est spécifique pour la construction du triazalone 12, d’autres triazalones d’intérêt ont été préparés à partir de 10 de cette manière ou d’une manière apparentée21). La triazalone 12 a ensuite été activée comme décrit précédemment16 par per-silylation en utilisant du méthylsilyltrifluoroacétamide (MSTFA) dans du THF (Schéma 1B). Séparément, le précurseur de monobactame 16 (22) a été traité avec du chlorosulfonylisocyanate dans du dichlorométhane, formant un adduit de sulfamoylchlorure; cet intermédiaire a ensuite été mélangé avec le triazalone activé 12, résultant en la construction du fragment monocarbam et en donnant 17 comme produit. Une déprotection par étapes de 17 et une purification par Chromatographie en phase inverse de 1 ont été suivies d’un traitement de cette substance avec 2 équivalents de bicarbonate de sodium dans de l’eau. L’isolement final du sel disodique de 1 a ensuite été accompli par lyophilisation23. Schéma 1: Représentation représentative du monocarbam: préparation de MC-1 (1), les DAS précoces pour les composés préparés de cette manière sont présentés dans le Tableau 1. L’organisme utilisé pour le criblage des MICs24, 800 était une souche virulente (non-MDR) de P. aeruginosa (1091-05) également utilisée pour des études d’efficacité in vivo.Les données SAR de cette enquête initiale ont suggéré que le site de liaison était tout à fait indulgent en ce qui concerne les aspects de polarité ou de taille modérée pour cette chaîne latérale de triazalone. Des groupes plus grands que le groupe méthyle ont été bien reçus (par exemple les composés 18 et 19) en plus des composés à fonctionnalité polaire tels qu’une amine basique (20) ou un alcool (composés 21 et 22). Les seules chaînes latérales étudiées qui n’étaient pas bien tolérées étaient celles contenant de très grands groupes (données non montrées) ou celles possédant une fonctionnalité aromatique (par exemple les composés 23 et 24). Cette DAS est en accord avec les études cristallographiques récentes de 1 lié à la protéine liant la pénicilline 3 (PBP3), indiquant une poche relativement grande dans la protéine où cette chaîne latérale réside.25Table 1P. CMI aeruginosa pour les analogues initiaux du monocarbam substitué par la triazaloneEncouragé par la flexibilité du SAR associé à cette chaîne latérale, nous avons sélectionné un ensemble de composés pour une évaluation plus approfondie afin de traiter la question des propriétés de la chaîne latérale triazalone en fonction de la performance in vivo. Parce que pratiquement tous les composés testés présentant de bonnes CMI contre P. aeruginosa 1091-05 (incluant 2) ont également bien fonctionné dans le modèle d’infection IP, nous nous sommes concentrés plutôt sur la performance RTI pour différencier les composés. Les composés choisis sont montrés dans le tableau 2. Les composés 1 et 25 ont tous une fonctionnalité polaire sur cette chaîne latérale, comprenant au moins un donneur de liaison hydrogène. Cependant, les chaînes latérales des composés 29 et 30 étaient plus représentatives du groupe méthyle de 2 en termes d’hydrophobie tout en conservant une taille globale comparable aux autres composés étudiés. Tous les composés étudiés présentaient d’excellentes CMI contre une souche productrice de Klebsiella pneumoniae (1000-02) à spectre étendu et un isolat clinique récent d’Acinetobacter baumannii (AB-3167), en plus de P aeruginosa (1091-05); de plus, ces composés présentaient également des valeurs MIC90 comparables à celles de plusieurs isolats cliniques de P. aeruginosa (Tableau 3). Tableau 2 Composés additionnels préparés pour étudier le rôle des propriétés physiques dans RTI EfficacyTable Résultats in vivo et in vivo des composés étudiés MC-1 (1 ) et 25 à 32 avec les agents comparateurs Aztreonam (3), Meropenem et U-78608 (2) Les résultats de cette étude ont confirmé que les composés contenant plus de fonctionnalité triazalone polaire étaient supérieurs en termes de leurs valeurs RTI PD50. En revanche, les composés 29 et 30 se comportaient plus comme 2 en ce qu’ils ne fournissaient pas de protection RTI significative dans la même gamme de doses. Ces données sont cohérentes avec les déterminations de fractions libres (PPB), qui ont généralement augmenté avec l’inclusion d’une fonctionnalité polaire [par exemple, fu-0,46 pour 1 contre 0,26 pour 2 (souris)]. Assez fortuitement, l’augmentation de la fraction libre n’a pas entraîné une augmentation proportionnelle de la clairance des médicaments. Ceci est probablement dû au fait que l’excrétion / la clairance du médicament pour ces composés n’est pas exclusivement médiée par la filtration glomérulaire du médicament non lié dans l’urine. Pris collectivement, ces résultats étaient en accord avec les données RTI PD50 observées, suggérant que l’amélioration de l’activité tissulaire est obtenue grâce à des concentrations plus élevées de médicaments libres sur le site de l’infection. Le manque de différenciation et les très faibles valeurs de PD50 dans le modèle IP étaient probablement le reflet des concentrations élevées de médicaments libres obtenues par voie systémique pour tous les analogues. En combinant ces résultats avec des études de la fréquence de résistance26 et d’autres tests MIC, 1 est apparu comme un composé intéressant pour un profilage plus poussé. Comme mentionné précédemment, un facteur de complication associé à l’étude 1 était son instabilité hydrolytique. L’instabilité des monocarbames est en grande partie une manifestation de la nature électro-attractrice du groupe activant la sulfonylurée. En plus de compliquer certains essais nécessitant des incubations à plus long terme, l’instabilité de la fraction de monocarbam a également entravé l’échelle synthétique de 1. Malgré cet obstacle, suffisamment de composé (1) a été produit pour mener des études pharmacologiques supplémentaires27 et toxicologiques28. . La dépendance au pH associée à l’ouverture de cycle hydrolytique du groupement β -lactame de 1 a été mesurée, et les résultats sont les suivants: à pH 6,0, 1 était relativement stable; cependant, à pH 8,0, une dégradation de 50% s’est produite en 100 h à 37 ° C (voir les renseignements à l’appui, figure 1). En conséquence, une stratégie employée pour améliorer la stabilité de 1 consistait à incorporer un groupe méthyle à la position C4 du cycle ß-lactame, tel que celui qui est présent sur 3. Dans le cas de 3, le Le rôle principal du C4-méthyle serait une meilleure stabilité vis-à-vis des β -lactamases.29 Cependant, d’autres études révèlent également un rôle des effets inductifs des substituants C4 – β -lactame dans l’activation (ou la désactivation) du β -lactame en direction de l’ion hydroxyde.30 Pour tester cette hypothèse, les composés 31 et 32 ​​ont été préparés par une séquence synthétique analogue à celle décrite pour 1 (Schéma 1). Comme on peut le voir d’après le tableau 3, ces composés présentaient des données in vitro comparables et une efficacité in vivo au moins aussi bonne que celle déterminée pour 1 et 25.31 Le composé 31 a été évalué pour sa stabilité hydrolytique aux côtés du 1 et du méropénème membrane cellulaire. A pH 6,0 et 37 ° C, 31 ont montré une stabilité similaire; cependant, à pH 8,0, 31 ont présenté une stabilité hydrolytique améliorée de façon mesurable par rapport à 1 et au méropénem32 pendant l’incubation de 100 h (dégradation de 20% par rapport à 50% pour 1 et le méropénème; Figure 1). Des études sont en cours pour déterminer si la nature et l’ampleur de cette amélioration de la stabilité sont suffisantes pour surmonter les obstacles associés au développement d’un composé de cette complexité.Tableau 4Contrôle MIC50 / 90 additionnel pour MC-1 (1) et agents de comparaison Aztreonam (3) MeropenemIn conclusion, nous avons décrit la synthèse de nouveaux monocarbams conjugués sidérophore avec une excellente activité in vitro et in vivo. De tels composés sont prometteurs pour le traitement d’infections graves causées par des pathogènes MDR tels que P. aeruginosa. Les composés 1, 31 et analogues apparentés présentaient une protection supérieure dans un modèle in vivo de RTI par rapport à U-78608 (2). Nos données d’une analyse des propriétés physiques suggèrent que la polarité et la présence de donneurs de liaison hydrogène sur la chaîne latérale triazalone de ces composés monocarbam affectent considérablement les résultats in vivo, vraisemblablement en raison des concentrations libres plus élevées atteintes dans les poumons. Alors que l’instabilité hydrolytique associée à 1 présente des défis pour son développement, l’impressionnante activité in vitro et in vivo de ce composé justifie une étude plus approfondie. Les efforts visant à augmenter la stabilité en incorporant un groupe méthyle-C4 β -lactame sur 1 (c’est-à-dire 31) se sont révélés prometteurs. Par conséquent, ces stratégies et d’autres visant à résoudre ce problème sont étudiées dans nos laboratoires et seront publiées en temps voulu.